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Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡
正常細胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內表面含負電的磷脂（如磷脂酰絲氨酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數的中性磷脂。在細胞凋亡的早期，細胞膜內的PS會從內側翻轉到細胞膜表面。
Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。
PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核染上。
因此Annexin V 和PI同時使用，可以將凋亡早期的細胞與其它細胞區別開來。
實驗步驟
細胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色）適用于：細胞未轉染GFP或未使用紅色藥物。
1．收集細胞：包括漂浮在培養基上的細胞；之后，須把EDTA洗去，PBS或培養基重懸送樣，正常組細胞分出200μl體積不染色；
2．離心：1000轉/分，5分鐘，棄上清；
3．重懸：加入200μl Binding Buffer，混勻；
4．染色：加入5μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10分鐘；
5．離心：1000轉/分，5分鐘，棄上清；
6．重懸：加入200μl Binding Buffer，混勻；
7．染色：加入5μl PI，直接上機。
注意事項
1．包括漂浮在培養基上的細胞，一起收集；
2．洗細胞后，建議輕輕搖勻細胞沉淀，避免使用加液槍，以免由于塑料槍頭的使用造成細胞損失；
3．一次檢測很多樣本，加入PI應該有一定的時間間隔（一般以30~60s為宜），因為PI本身有毒。
對照組凋亡比例高的原因
1．細胞狀態不好；
2．細胞收集后存放的時間太長，沒有及時染色；
3．細胞表面原有的PS相對較多，應選用低濃度的AnnexinV標記；
4．PBMC表面往往有血小板黏附在細胞表面，造成Annexin V陽性率偏高；
5．過分吹打、震蕩或胰酶消化等，可能使PS暴露出來。
處理組凋亡比例低的原因
1．凋亡刺激得不夠；
2．細胞本身生長狀態可能對刺激因素不敏感，如過度增殖的細胞對凋亡的誘導不太敏感；
3．Annexin V的結合緩沖液失效，應4 ℃保存；
4．貼壁細胞消化時間過長，膜表面的PS受損，Annexin V結合位點減少。