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新手必備 | 手把手教你做蛋白免疫共沉淀。
蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
實驗原理
免疫共沉淀的原理是使用靶蛋白特異性抗體間接捕獲與特定靶蛋白結合的蛋白來鑒定體內相關的蛋白-蛋白相互作用。具體來說，當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。此時，如果加入特異性抗體，抗體可以和已知的抗原（即靶蛋白）形成抗原-抗體復合物。如果在系統中存在與已知抗原相互作用的蛋白質，該蛋白質也會以復合物的形式沉淀下來。經過洗脫后，可以得到與已知抗原相互作用的蛋白質，再進行SDS-PAGE及Western blotting分析。
操作攻略
轉染后24~48小時可收獲細胞，加入適量RIPA細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。細胞裂解液于4°C、最大轉速離心30分鐘后取上清。
取少量裂解液以備Western blot分析（Input），剩余裂解液加1μg相應的抗體到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；對照組直接加入跟所用抗體同種型對照。
取10μl protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3000rpm離心3分鐘。
將預處理過的10μl protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4°C緩慢搖晃孵育2~4小時，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。
免疫沉淀反應后，在4°C以3000rpm速度離心3分鐘，將瓊脂糖珠離心至管底；小心吸去上清，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3~4次；最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。
進行SDS-PAGE、Western blotting或質譜儀分析，通過免疫共沉淀確定結合蛋白。
轉染后24~48小時可收獲細胞，加入適量RIPA細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘。細胞裂解液于4°C、最大轉速離心30分鐘后取上清。
取少量裂解液以備Western blot分析（Input），剩余裂解液加1μg相應的抗體到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；對照組直接加入跟所用抗體同種型對照。
取10μl protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3000rpm離心3分鐘。
將預處理過的10μl protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4°C緩慢搖晃孵育2~4小時，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連。
免疫沉淀反應后，在4°C以3000rpm速度離心3分鐘，將瓊脂糖珠離心至管底；小心吸去上清，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3~4次；最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。
進行SDS-PAGE、Western blotting或質譜儀分析，通過免疫共沉淀確定結合蛋白。
注意事項
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細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。
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在準備做磷酸（酯）酶實驗時，不要加磷酸酯酶抑制劑。
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配制工作液時，理論上蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入，但PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。
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